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真相来了！为什么核酸检测 “ 假阴性 ” 比例高？

2021/3/9




PCR
疫情中的PCR

随着新冠病毒（COVID-19）的全球大流行，截至今天已经造成了1亿人的累积确诊，死亡人数更是超过了250万（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）。病毒核酸检测是诊断新冠肺炎的主要方法，逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是目前用于临床核酸检测最广泛的方法。虽然RT-qPCR是检测核酸的金标准，但是其他方法也应用于疫情的防控，其中包括了数字PCR（dPCR，digital PCR）技术，相比于qPCR，数字PCR是一项新兴的核酸检测技术，应用于核酸的绝对定量检测，具有高灵敏度，高精确度的优点。



数字PCR和RT-qPCR核心都是基于聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），RT-qPCR又是在PCR技术的基础上进行了改进，反应物中添加了荧光染料或利用荧光分子标记的探针，通过实时检测荧光强度计算DNA模板的扩增量，从而实现对于核酸的定量检测，实现相对定量的检测。



而数字PCR基于限定稀释的概念，将反应体系分割成无数小的反应体系（液滴/微室），每个体系中包含PCR反应的各项成分，经过热循环反应后对液体的荧光值进行检测，利用泊松分布计算阳性/阴性的反应体系数量，从而达到对靶标的检测。相对于RT-qCPR数字PCR不需要校准曲线，其线性数字信号的读出比qPCR指数放大信号更为准确，这一优势使得dPCR在技术上优于qPCR。




虽然，RT-qPCR由于其技术上的限制以及样本病毒量的限制，有出现假阴性的概率，已有多篇文献报道SARS-CoV-2病毒检测的不稳定性；影响假阴性RT-qPCR结果因素很多，包括了引物或靶位点突变，样本获取/处理不当，以及样本中存在扩增抑制剂；而数字PCR属于终点法检测，对于反应过程中的抑制剂具有较高的敏感性和耐受性，已经被用于新冠病毒的检测，以减少假阴性结果发生的概率；已有研究表明，经过RT-qPCR检测的阴性样本经过数字PCR检测为阳性，表明了在低病毒样本量的检测中，数字PCR的优于RT-qPCR，现阶段可以作为其补充。


由于数字PCR的绝对定量特性，即使病毒载量很小，也可以检测出阳性样本（低至数十拷贝），而目前疫情防控中，常常要做到如冷链产品，各种环境中病毒检测，这类检测中病毒载量极小，相比之下数字PCR的具有更好的优势；

此外，由于新冠病毒属于RNA病毒，具有较高的突变率；而数字PCR相对于RT-qPCR可以更好的检测样本的基因突变检测，商业化的数字PCR系统检测灵敏度高达0.01％，对于病毒的溯源和研究提供了良好的手段。




PCR
商业数字PCR的发展


1992年，Sykes等人基于限定稀释的理论首次提出了数字PCR( digital PCR,dPCR )概念；随后的1999年，Kinzler和Vogelstein首次使用“ digital PCR ”一词发表论文，他们描述了通过对样品进行分区来定量ras突变的方法，以便在微孔板中进行一系列PCR；而随着技术的发展，数字PCR检测通量进一步扩大；包括了在集成流路芯片上进行数字PCR反应，2006年Fluidigm基于这种芯片技术推出了第一台商业化数字PCR系统，the BioMark?，该系统基于微芯片设计，具有小的腔室和阀门用于分割样品和试剂；第一代芯片数字PCR使用阵列芯片，12通道，765分区；2009年，更新了第二代芯片，使用48通道，770分区，提高了吞吐量并降低了使用成本；同样是2009年，Life Technologies推出了OpenArray? system，该系统采用了带有超过3000μm大小的板，通过表面张力维持PCR混合物；2013年，推出了高密度纳米流控芯片，可携带20000数据点，简化了工作流程，极大降低了成本；2014年，Formulatrix推出了Constellation system 利用96孔板微流控系统，每孔包含496小室，可单独进行PCR反应。

此外还有一种基于乳状液珠包裹PCR反应物-液滴数字PCR的方法，液滴dPCR的工作流程包括了生成含有PCR反应物的水-油微滴，精确调节PCR和油脂化学的设备可以产生数千或者百万纳米升或皮升的均匀液滴，能够通过微流控通道的快速流动和热循环过程，而不会破裂或聚合。2011年，Bio-Rad公司推出了QX100 Droplets dPCR系统，利用探针法进行检测；随后推出的QX200微滴式数字PCR系统利用探针和嵌入式染料进行PCR检测；两个系统都可以产生大约20000纳米级液滴，与早期PCR芯片相比成本极大降低；同样是2012年，Rain Dance  Technologies推出了RainDrop? system可以产生百万皮升级PCR混合液滴。

数字PCR的工作流程非常简单；在芯片型dPCR系统中，PCR mix，PCR混合物通常在加载设备的帮助下分布在预制的隔板上，装载的芯片置于循环加热器上进行PCR反应，热循环完成后，使用相机成像芯片对每个分区的荧光强度进行分析，将含有目标分子的分区（正分区）和没有目标分子的分区（负分区）区别开来；基于归一化的荧光强度信号，应用一个阈值来分配分区的正负。一些基于芯片的系统也会收集实时的数据，因此可以提供Cq值。




而对于液滴数字PCR系统，PCR混合物和油通常被移入滤筒的孔中，然后滤筒被转移到专门设计的仪器中，在仪器中产生油包水乳状液。液滴乳剂转移到96孔板的孔中或管条中的管中，然后放入热循环器进行PCR扩增；热循环后，平板或管被转移到液滴读数仪器上，液滴被吸入并以类似流式细胞仪的方式快速流过荧光检测器，用于测量每个液滴中的荧光。根据荧光信号，应用一个阈值将液滴分配到正或负液滴种群中。

数字PCR是一种绝对定量的终点检测方法，可以提供超灵敏和绝对的核酸定量。这种技术对于低丰度目标、复杂背景下的目标、等位变异(SNPs)和监测目标水平的细微变化特别有用。随着数字PCR技术的发展其应用范围得到更广阔的拓展，包括各种病原体的检测，食品安全监督，水质检测，微生物生态学研究；由于数字PCR具有较高的准确度，因此可以检测出微小核酸分子的数量差异用于临床研究，包括生物标志物的开发和检测；癌症患者基因组扩增窗台和基因变异的检测；遗传筛查；基因组编辑，干细胞中单核苷酸的突变和拷贝数检测；以及在移植受体这体内检测移植物来源的DNA和嵌合体；因此领先的研究小组和生命科学工业界开发基于数字PCR技术的测试，将数字PCR技术用于分子诊断。


MicroDrop?是由永诺生物研发并投入生产的国内首款微滴式数字PCR检测系统，是我国首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR仪，可广泛应用于科研、医疗、出入境检验检疫等领域。







References
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